Rani Mukerji dilahirkan di Mumbai pada 21 Mac 1978.[2] Bapanya, Ram Mukherjee (lahir kepada keluarga Mukherjee-Samarth), ialah bekas pengarah filem dan salah satu pengasas Filmalaya Studios. Ibunya, Krishna Mukherjee, ialah bekas penyanyi latar.[3] Abangnya, Raja Mukherjee, ialah penerbit dan pengarah filem.[4] Ibu saudara sebelah ibunya, Debashree Roy, adalah seorang pelakon filem Bengali dan sepupu sebelah bapa, Kajol, adalah seorang pelakon filem Hindi dan kontemporari beliau.[5] Seorang lagi sepupu sebelah bapa, Ayan Mukerji, ialah pengarah penulis skrip dan filem.[6] Walaupun ibu bapanya dan kebanyakan saudara-mara beliau menjadi anggota industri filem India, Mukerji tidak berminat untuk meneruskan kerjaya dalam filem.[7] Beliau berkata, "Terlalu ramai pelakon di rumah dan saya mahu menjadi seseorang yang berbeza".[8]

Mukerji mendapat pendidikan di Maneckji Cooper High School di Juhu dan lulus dengan ijazah dalam Sains Rumah dari Universiti Wanita SNDT.[9] Beliau merupakan penari Odissi terlatih dan mula belajar bentuk tarian semasa dalam gred yang kesepuluh.[10] Sebagai sebahagian daripada tradisi tahunan, keluarga Mukherjee meraikan perayaan Durga Puja dalam kejiranan pinggir bandar Santacruz setiap tahun. Mukerji, seorang beragama Hindu, mengambil bahagian dalam perayaan dengan seluruh keluarganya.[11][12]

Pada tahun 1994, pengarah Salim Khan mendekati beliau memainkan peranan wanita utama dalam arahannya, Aa Gale Lag Jaa. Bapanya tidak bersetuju dengan kerjaya sepenuh masa dalam filem pada usia yang muda, jadi beliau menolak tawaran itu. Pada usia lapan belas tahun, Mukerji bereksperimen dalam lakonan dengan dengan membawakan peranan sokongan dalam filem bahasa Bengali bapanya Biyer Phool (1996).[13] Filem ini dibintangi Prosenjit dan Indrani Haldar dalam peranan utama dan menceritakan kisah dua adik-beradik; Mukerji membawakan adik-beradik yang lebih muda watak Haldar. Tidak lama selepas itu, Khan mendekati beliau dengan tawaran filem lain untuk membawakan protagonis drama sosial Raja Ki Aayegi Baraat, Mukerji menerima peranan kerana desakan ibunya bahawa beliau terus mengejar lakonan secara eksperimen.[14] Sebelum mula bekerja pada filem itu, Mukerji dilatih di institut lakonan Roshan Taneja.[15]